Practical Techniques in Molecular Biotechnology

索书号：Q81/S617/2021/Y

ISBN：9781108486408

藏书地点：武大外教中心

随着生命科学和化学的不断发展，人们对生物体的认知已经逐渐深入到微观水平。从单个的生物体到器官到组织到细胞，再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平，人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构(如核酸序列)，来横向比较不同物种，同物种不同个体，同个体不同细胞或者不同生理(病理)状态的差异。这就为生物学和医学的各个领域提供了一个强有力的技术平台。

常用的分子生物学技术有如下几种：PCR单链构象多态性分析，变性梯度凝胶电泳，双链构象多态分析法等。

PCR-单链构象多态性分析(PCR-single strand conformation analysis, PCR- SSCP) 是近年来在基因突变检测中运用最广泛的方法之一。PCR-SSCP 技术凭借突变可引起单链DNA三级构象改变，通过观察单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率漂移来判断突变。样品经PCR 扩增后，其产物经变性后可以产生2 条单链，如果存在基因突变，哪怕是一个碱基的异常，单链的构象也会发生变化，正常与突变的DNA单链在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 中，可以显现出不同的带型，从而确定野生型和突变型，PCR- SSCP分析的主要优点是简易且敏感性较高。但该技术不能确定突变的部位和性质。PCR- SSCP 突变检测敏感性随PCR 产物长度的增加而降低，一般用于检测较小外显子的突变。有时由于单个核苷酸变化所引起的构象改变很小，用PAGE 电泳就可能无法检出，在PCR 产物或待测DNA 小于200 bp 时，PCR-SSCP分析能够检测出70%~ 95%的突变。如果以毛细管电泳代替PAGE，则可大为提高突变检测的效率。

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 利用由碱基序列所决定的DNA片段溶解度或变性度的差异，达到分离野生型与突变型DNA片段的目的，该手段分辨率达一个碱基。当DNA 双链沿变性剂浓度梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶迁移时，DNA分子中解链温度(Tm) 低的部分逐渐变性解链。一般总是错配碱基部分的异源双链Tm最低，最容易解链，其次是富含AT 碱基对的部位，富含GC碱基对的部位Tm值较高所以解链较难。因此，正常DNA双链和异源双链在梯度变性胶中电泳时，异源双链总是先解链。将PCR 产生的双链DNA在浓度递增的尿素和甲酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当某一DNA片段迁移到变性剂浓度与其最低Tm相当的位置时，该片段低温解链部分的双链打开，部分解链导致DNA迁移速度明显下降，观察样品的迁移率变化即可判断是否存在变异。DGGE 敏感性高，即便异源双链中仅含一个错配碱基，在电泳时也可分辨其迁移率的改变。DGGE 方法的单碱基突变检出率在DNA片段长度600 bp 以内可以达到95%。

双链构象多态分析(double- strand conformation analysis, DSCA) 是利用荧光标记引物，通过PCR 扩增出相关的研究片段作为荧光标记参照(fluorescence labeled reference, FLR)DNA分子。然后，用标记参照物FLR 分子与待测PCR扩增片段进行杂交。因为FLR 和样本核苷酸序列相似，杂交反应液中所有DNA的正链和反义链之间将形成双链结构。只有与带荧光标记的FLR 分子正链匹配的DNA双链，经过电泳后方可被DNA测序仪的激光检测系统所检测。所以，可检双链均有一样的FLR 正链，杂交双链的电泳迁移率可能相同，但是由于反义单链的差异双链变性程度的差异而最终造成电泳迁移率的不同。不像SSCP 技术，DSCA能够任意操纵变性双链的形成，选用不同的FLR可以达到难分样本的最佳分离效果。另外，通过调整FLR 和样本待测DNA分子的比例，可专一性增强杂交异质双链信号并减弱纯合双链信号。DSCA技术的优点还在于它依据样品经过固定检测仪的时间差，而非相同电泳时间迁移的距离差来判断突变的有无，这样就避免了诸如SSCP 等技术分析中因迁移速率差异而降低的泳动速度慢的条带检测率。另一方面，DSCA的有效检测片段长度可达1 kb。由于激光系统的介入，DSCA的灵敏度和上样量分别得以提高和降低，不到1 秒的泳动差异也足以检测。该技术已被成功地用于囊性纤维化基因(cystic fibrosis gene) 的4 种突变.

《分子生物学的实用技术》一书于2021年由Cambridge University Press出版社出版，作者是Bal Ram Singh和Raj Kumar。本书旨在使学生熟悉分子生物技术相关课程的理论知识和实验操作，如化学生物技术和细胞生物学。本书的内容将有助于加强学生的基本技能，并帮助学生将概念应用于现实问题。这本书强调了一些重要的概念，如生物分析技术，蛋白质的生化分析，重组DNA和蛋白质技术等。本书将帮助学生们理解这些实验技术的理论背景，并提供技术指导。

本书作为研究分子生物学技术的专业书记，内容专业详实，语言浅显易懂。适合在大学课程中学习分子生物技术或感兴趣的读者阅读。

除此之外本书还有以下特点：

1、本书不仅介绍了分子生物学的理论知识，还对分子生物学在各类学科中的应用进行了阐述，使读者能够更加全面的了解该领域的专业知识。

2、索引文献丰富，证明了这本书的知识性，真实性。而且，这些索引文献绝大部分都是最新研究，让读者全面了解该领域的前沿进展。

3、在本书的最后，将出现的专业词汇都罗列出来，大大方便了大家在阅读过程中对分子生物学研究的专业术语的认知。

4、本书最鲜明的特点就是图片生动形象，语言浅显易懂，语言介绍的同时，附上可以说明问题的图片，使得分子生物学相关专业知识变得简单易读，对初学者有很大的帮助。

本书目录

1. 引言

2. 重组DNA和蛋白质技术

3. 酶动力学，蛋白质组学和质谱分析

4. 生物分析技术

5. 分子生物学

6. 细胞培养

7. 抗体技术

兰天武汉大学生命科学学院博士研究生