蛋白质生物技术基础
Fundamentals
of protein biotechnology
作者：Stanley Stein
出版社：CRC Press
索书号：Q510.3/F981/2019/Y
ISBN：9780367403133
藏书地点：武大外教中心
分子生物学技术是在20世纪70年代初兴起的。在当时的许多人看来，这意味着蛋白质化学的终结。多数最初克隆的蛋白质，如胰岛素和生长激素，在分子生物学出现之前就已经完全用化学方法进行了表征。70年代中期，分子生物学家在某种程度上绕过蛋白质化学，因为它在重要蛋白质的研究中没有用处，且丰度很低。当时已经可以测量到皮摩尔及以下的生物活性，虽然分子生物学也在这个范围内工作，但蛋白质化学仍在纳米分子范围内工作，这种敏感度的差异促使分子生物学家开发出巧妙的方法来绕过蛋白质的分离和鉴定。现如今，使用表达克隆方法，仅仅通过蛋白质的生物学或免疫学特征就可以克隆和测序蛋白质的cDNA。然而，随着时间的推移，人们对蛋白质化学重新产生了兴趣，引入了微量分析方法，包括化学分析、分离、氨基酸分析和测序。当今，蛋白质化学也在皮摩尔范围内研究。此外，蛋白质化学包含了仅靠分子生物学无法获得的信息。首先，即使获得有限的分离蛋白序列信息，也可以制备合成的脱氧核苷酸，这些脱氧核苷酸在克隆相应的cDNA时可以起到相当大的探针作用，这对克隆相应的cDNA有很大帮助。这在试图克隆稀有蛋白质(如激素、生长因子和受体)时尤为重要。由蛋白质测序得出的知识在确定蛋白质的氨基末端方面通常也比单独的cDNA测序更精确。最后，活性蛋白或肽经常经历相当多的翻译后加工，这是从cDNA中无法预测的，即肽酶的切割、磷酸化、糖基化、亚基聚集等。DNA被称为生命的蓝图。如果是这样的话，那么由特定cDNA编码的每个蛋白质都可以被认为是一个单独的结构。
分子生物学和遗传学的出现带来了一场技术革命。由于分子生物学的高度关注，大多数人都意识到了研究DNA和RNA方法的进步。然而，直到近35年，人们才开始认识到蛋白质是由15到20种不同氨基酸组成，氨基酸以固定的顺序排列。最早的氨基酸测定方法是对蛋白质水解物中的每种氨基酸进行“特异”沉淀，这种化验方法需要大量的蛋白质，在实验室很难重现。此外，它们没有足够的特异性，而且并不是所有的氨基酸都有试剂可用。1950年，氨基酸的微生物检测方法问世。某些细菌可以在缺少一种氨基酸而其它所有氨基酸都过剩的培养基中生长，因此，在添加蛋白质水解物时，有机体的生长与该氨基酸的浓度成正比。例如，为了测定亮氨酸，使用了一种含有除亮氨酸以外的所有氨基酸的培养基。添加蛋白水解物后，有机体生长与亮氨酸含量成正比。测定一种蛋白水解物的每种氨基酸需要用特定的培养基和对照、空白等孵育。微生物法比沉淀法灵敏(100-200µg)，但耗时长，不能得到令人信服的计量数据。同时介绍了氨基酸测定的同位素导数法。用同位素稀释法分别测定标记水解液中的每一种氨基酸。这种方法足够精确和特异，首次表明当时可用的所有蛋白质，除了胶原，都含有小于0.05的羟脯氨酸残留量。这种方法很灵敏(蛋白质含量很高)，但还是很费力。直到Stein和Moor引进了Nin-Hydrin氨基酸分析仪，并帮助引进了商业自动化分析，氨基酸分析才达到了化学分析所需的灵敏度、精密度和相对简便性。当然，正是柱层析的引入使氨基酸分析仪成为可能。由Beckman Instrument等公司推出的商用氨基酸分析仪终于使蛋白质化学家获得了证明每种蛋白质都有独特的氨基酸组成所需的精确度。直到大约1年前，在原Steinand Moore仪器的基础上几乎没有改进的金刚三酮氨基酸分析仪代表了主导技术。然而，直到最近，大多数商用氨基酸分析仪的灵敏度极限是每种氨基酸约1纳摩尔。随着高效液相色谱(HPLC)、新的荧光和比色试剂以及现代计算机技术的引入，现在已将灵敏度极限提高到了羟解物中每种氨基酸的几个皮摩尔。现在有几种程序和仪器通常工作在皮摩尔范围内。
当前，所谓蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定。蛋白质的一级结构（Primary structure）包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。测定步骤主要分为：1.多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链（亚基）；2.测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目；3.二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化；4.测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；5.分析多肽链的N-末端和C-末端：多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸（amino-terminal）和C-端氨基酸（Carboxyl-terminal）；6.多肽链断裂成多个肽段：可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来；7.测定每个肽段的氨基酸顺序；8.确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序；9.确定原多肽链中二硫键的位置。
《蛋白质生物技术基础》一书于2017年由CRC Press出版社出版，作者是Stanley Stein。
本书作为研究蛋白质生物技术的专业书目，内容专业详实，语言浅显易懂，除此之外还有以下特点：
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4.本书语言浅显易懂，图文并茂，对跨领域学习者有很大的帮助。
本书目录
1.蛋白质生物技术的发展概况和历史展望。
2.蛋白质结构。
3.蛋白质生物合成。
4.蛋白质的纯化及液相色谱和电泳分析。
5.作为生物效应器的蛋白质。
6.天然蛋白质的分离。
7.大规模生产重组蛋白：人白细胞干扰素。
8.利用重组DNA技术生产人降钙素。
9.蛋白质的结构分析。
10.多肽的化学合成。
11.利用重组DNA技术生产和分析蛋白质。
12.单克隆抗体
兰天 武汉大学生命科学学院 硕士研究生