Three-Dimensional
Electron Microscopy
三维电子显微镜
作者：Thomas
Müller-Reichert, Gaia Pigino
出版：Academic
Press
索书号：Q2/M592/2019/V.152/Y
ISBN: 978-0-12817-018-2
藏书地点:武大外教中心
聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）已成为生命科学中一种广泛使用的技术。为了获得最佳的数据质量，样品制备很重要。本文说明了三种用于小鼠神经组织的制备程序：首先，作为直接和快速的程序，在冷冻条件下，在冷冻条件下使用高压冷冻法对玻璃化的组织进行直接成像，而在FIB-SEM中没有任何染色。第二，缓慢的过程涉及冷冻样品的冷冻替代，结合额外的染色以增强对比度和塑料包埋。第三，采用微波辅助化学固定和树脂包埋加工的快速制备方法。
迄今为止，可以使用不同的电子显微镜（EM）方法（例如TEM，SEM，STEM，CLEM等）来收集从微米级到纳米级的组织和细胞中的三维（3-D）信息。但是，存在大量重建生物物质的可能性和方法。在本文中，概述了通过串行块面/聚焦离子束SEM和阵列层析成像（AT）生成3-D扫描电子显微镜（3-D SEM）数据的两个标本处理工作流程。我们将这些常用的工作流程应用于啮齿动物和斑马鱼肝脏作为模型实验系统。为此，我们概述了每个过程的具体步骤，并深入讨论了每种3-D SEM样品处理工作流程的优势与局限性。
自动卷带式超薄切片机（ATUM）是一种卷带装置，可将其放置在充满水的金刚石刀船中，以收集由常规超薄切片机切割的连续切片。ATUM可以收集成千上万个形状和大小各异的切片，然后通过扫描电子显微镜对其进行成像。该方法已用于小鼠脑的大规模连接组学项目，非常适合于组织，细胞和生物的其他较小规模的研究。在这里，我们描述了为ATUM切片准备块，ATUM的处理，磁带准备，切片的后处理以及映射，成像和对齐串行切片的注意事项的基本过程。
有多种技术可用于获得纳米分辨率的3D图像。在过去的十年中，人们越来越有兴趣在生命科学研究的不同领域中应用串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）。这项技术的优势在于，它可以覆盖从三个层面上的单层到多层组织的各种体积。SBF-SEM最初用于神经科学，然后扩展到其他研究领域。SBF-SEM样品制备的整个过程很长，并且包含许多步骤，这使得给定工作流程的调整非常困难。在这里，我们描述了SBF-SEM工作流程以及该过程中可以针对任何样品进行调整的那些步骤。
电子显微镜可以自动采集可以以三维（3D）格式重建的连续切片成像数据，以提供细胞超微结构的详细，几何精确的视图。体积电子显微镜（EM）技术，串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）两种技术使用相似的切片和观察方法，但它们的视野不同和3D分辨率。本章重点介绍了一种工作流程，其中SBF-SEM能够对大视野成像的能力与FIB-SEM的精确切片能力相结合，可以首先定位大组织体积中的罕见细胞事件，然后以更高的分辨率检查事件。
在应激条件下，酵母必需酶能够在细胞质中组装并形成无膜的区室（Narayanaswamy等，2009）。这些微区隔在细胞进行pH调节和分子拥挤时会在ATP耗竭下迅速形。到目前为止，大多数这些酶的行为已通过使用荧光显微镜的实时成像进行了表征。已解决了组装形式中仅有的几种酶的超微结构，从而揭示了它们形成高度有序的自组装的能力。在这里，我们展示了如何使用相关的光电子显微镜（CLEM）和透射电子断层扫描（ET）来揭示原位酵母酶eIF2B（真核翻译起始2B）在能量耗尽时呈区室化形式所采用的排列方式。
我们描述了一种常规方法来定位秀丽隐杆线虫性腺，减数分裂阶段的细胞男性在通过电子断层扫描进行减数分裂纺锤体3D重建之前。为此，对整个蠕虫的连续半厚（300 nm）切片进行预筛选，并通过透射电子显微镜以低放大倍率记录下来。在对齐的图像堆栈中识别出感兴趣的细胞，这些图像堆栈在低放大倍率下显示了雄性腺的整个近端区域。然后以更高的放大倍数记录所选细胞的倾斜系列，以3D重建所选细胞的减数分裂纺锤体。我们的方法允许对精母细胞进行常规分期，而无需使用麻醉剂或对蠕虫进行物理固定。
为了自动获取用于电子断层扫描的倾斜系列，软件需要处理复杂性，例如样品在x、y和z中的移动，在高倾斜下增加的投影厚度，样品漂移等。此外，许多应用还需要特殊功能，例如低剂量采集，自动连续（批量）断层扫描或蒙太奇断层扫描。
在回顾了如何解决这些困难并仔细研究了生物科学中采用的高级采集策略之后，本章介绍了学术界以及硬件厂商开发的采集软件。它涵盖了硬件要求和兼容性，实现的功能原理和工作流程，以及各个程序支持哪些高级功能。
原位低温电子断层扫描（cryo-ET）和子断层图平均是功能强大的工具，能够在亚纳米分辨率下提供生物样品的3D结构，同时保留有关细胞背景和高阶组装的信息。当将其应用于高度重复的结构（例如病毒）时，通常会获得最佳结果。其他典型的例子是蛋白质复合物，如成年的和精确的重复，沿着睫毛微管长延伸，例如轴突达因素。对于这种情况，存在大量的子子图平均协议。在本章中，我们将展示如何使用cryo-ET和子图平均法研究鞭毛内运输（IFT）机械的体系结构，这是一个更具挑战性的目标，仅在每个层析X射线照片中仅显示低拷贝数。在IFT火车上，IFT衔接子蛋白的重复单元与两个相反方向的分子马达接合，以快速将纤毛结构单元和其他蛋白穿梭到纤毛末端和/或返回到碱基。IFT系列的这种动态和零星的性质给确定要平均的粒子的定位或精确方向提出了挑战。这些问题的解决方案都将在本文中介绍。
《三维电子显微镜》一书于2019年由Academic
Press出版，作者是Thomas Müller-Reichert, Gaia Pigino。
《三维电子显微镜》一书中，研究人员介绍了三维电子显微镜的使用技术和方法，重点是最近的技术发展，讨论的主题主要包括十三个部分。《三维电子显微镜》一书从各个方面讲解了三维电子显微镜的基础内容和研究方法，旨在为想要进一步研究三维电子显微镜的研究人员提供简明易懂的介绍以及方法技术指导。
《三维电子显微镜》一书作为电子显微镜方面的专业研究读物，观点新颖独到，内容饱满详实、语言浅显易懂，除此之外，还包括一些其他的特点：
1、本书分为十三个章节，既讲解了三维电子显微镜过程的基础知识，还讲解了深入研究三维电子显微镜，是一本应用性很强的书籍，对于想要学习如果研究三维电子显微镜的研究人员来说是一本很有意义的指导书籍。
2、每个章节都是由相关领域的专业人士所撰写，因此，本书讲解既详细又专业，作者能够从中了解到三维电子显微镜相关的专业知识以及最新的前沿进展。
总的说来，《三维电子显微镜》一书为想要了解三维电子显微镜研究方法的人员提供了清晰的导读路径，作为三维电子显微镜领域的一本前沿研究图书，是一本值得为想要涉足该领域的人员推荐的专业书籍。
本书目录
第1章-小鼠神经组织的FIB-SEM：快速和慢速样品制备
Anna M. Steyer，Andreas Schertel，Christos Nardis，WiebkeMöbius
第2章-加快了用于比较显微解剖成像的大容量3-D SEM工作流程
Gerald John Shami，Delfine Cheng，Filip Braet
第3章-使用自动胶带收集超薄切片机（ATUM）进行的连续切片电子显微镜
瓦伦蒂娜·贝娜（Valentina
Baena），理查德·李·沙勒克（Richard Lee Schalek），杰夫·威廉·利希特曼（Jeff William Lichtman），马克·寺崎（Mark Terasaki）
第4章-用于体积电子显微镜的串行块面扫描电子显微镜
Saskia Lippens，Anna Kremer，Peter Borghgraef，ChristopherJ.Guérin
第5章-结合串行块面和聚焦离子束扫描电子显微镜对稀有事件进行3D研究
克里斯托弗·J·格琳（ChristopherJ.Guérin），安娜·克雷默（Anna Kremer），彼得·博格格拉夫（Peter Borghgraef），安迪·施（Andy Y.Shih），萨斯基亚·利彭斯（Saskia Lippens）
第六章-相关光学显微镜和电子断层扫描显露的酵母无膜隔室
盖亚·皮吉诺（Guia Gaino
Pigino）
第7章-秀丽隐杆线虫的男性减数分裂的原位分析
Gunar Fabig，Anna Schwarz，Cynthia Striese，Michael Laue，ThomasMüller-Reichert
第8章-电子断层扫描倾斜序列自动采集软件
根特·P·雷施（Guenter P.Resch）
第9章-鞭毛内运输火车的原位冷冻电子断层扫描和断层摄影平均
玛丽亚·乔丹（Mareike
A.Jordan），盖亚·皮吉诺（Gaia Pigino）
第10章-生物学中的CryoSTEM层析成像
莎朗·沃尔夫（Sharon G.
Wolf），迈克尔·埃尔鲍姆（Michael Elbaum）
第11章-低温电子断层图的子断层图平均
Kendra E. Leigh，Paula P. Navarro，Stefano Scaramuzza，Wenbo Chen，... Misha Kudryashev
第12章-串行截面数据的缝合，对齐和伪影校正的计算方法
斯蒂芬·萨尔费尔德（Stephan
Saalfeld）
第13章-用于电子显微镜的内容感知图像恢复
Tim-Oliver Buchholz，Alexander Krull，RézaShahidi，Gaia Pigino，... Florian Jug
林岚 武汉大学生命科学学院 博士研究生